無菌隔離器滅菌方法

　　1、菌懸液的制備

　?、偃〗瘘S色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液15ml；菌懸液平均分裝于3小藍蓋瓶內，瓶口密封(包裝形式與無菌檢查供試品一致)，2～8℃冰箱存放，24h內備用。

　?、谌“咨钪榫男迈r培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝及保存。

　?、廴『谇沟男迈r培養物加入3～5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后取孢子懸液至無菌試管，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的孢子懸液15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝，2～8℃冰箱存放，2月內備用。

　　2、無菌隔離器的準備

　　以無菌隔離器裝載量的要求將無菌檢查所需物品擺放到無菌隔離器內部相對應的位置；無菌隔離手套及艙體密封性測試合格；運行參數已確認。

　　3、過氧化氫氣體濃度及分布狀態確認

　　取19支過氧化氫蒸汽化學指示劑編號，放入無菌隔離器的手套部位、進出風口、風扇背部、艙體上下四角及垃圾桶底部，滅菌完成后觀察變se情況。

　　4、BI挑戰實驗

　　取13支過氧化氫滅菌生物指示劑(嗜熱脂肪芽孢菌片)分布于無菌隔離器的8個手套部位、左右艙門、艙體操作臺面的左右及垃圾桶底部，滅菌完成后菌片取出接種于胰酪大豆胨液體培養基中，56℃培養，培養7天，觀察培養物的生長情況，同時取未經滅菌的生物指示劑3片同法接種，作為陽性對照。

　　5、無菌隔離器開啟滅菌

　　開啟無菌隔離器的自動運行程序，依次按照“自動除濕”、“自動調節”、“自動滅菌”、“自動通風”、“自動保壓”五個階段完成運行程序。

　　6、沉降菌檢測

　　取胰酪大豆胨瓊脂平皿培養基15個，擺放在隔離器艙體操作臺面上，臺面兩側各放置6個平皿，臺面左右兩側各放置1個平皿，垃圾桶底部放置1個平皿。平皿暴露采樣4小時，同時取3只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20～25℃培養箱中培養72小時后，再轉入30～35℃培養箱中培養48小時，記錄培養皿中菌落數量。

　　7、浮游菌檢測

　　取樣點為隔離器操作平臺的左右各1個點，使用胰酪大豆胨瓊脂平皿，在取樣點工作區附近放置取樣器，進行空氣取樣，各取樣點的取樣量為1000升，同時取3只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20～25℃培養箱中培養72小時后，再轉入30～35℃培養箱中培養48小時，記錄培養皿中菌落數量。

　　8、表面微生物的檢測

　　取胰酪大豆胨瓊脂接觸碟培養基6個分別對隔離器艙體內表面的上部、下部、左部、右部、前部、后部進行接觸10秒采樣；取胰酪大豆胨瓊脂接品平皿培養基(TSA)分別對8個手套指模進行取樣，同時取3只培養基作空白對照，采集完的培養基及空白對照培養基置于20～25℃培養箱中培養72小時后，再轉入30～35℃培養箱中培養48小時，記錄培養皿中菌落數量。

　　9、選擇性微生物挑戰試驗

　　①試驗組一：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經無菌隔離器過氧化氫蒸汽滅菌，接種計數。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml接種于TSA上，平行接種兩次，30～35℃培養48～72小時，菌落計數，取平均值；取白色念珠菌、黑曲霉菌懸液1ml接種至沙氏葡萄瓊脂培養基上，平行接種兩次，30～35℃培養3～5天，菌落計數，取平均值。

　　②試驗組二：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經無菌隔離器過氧化氫蒸汽滅菌，并在滅菌完成后拆開菌懸液瓶口，使內容物在無菌隔離器內暴露5min，然后同試驗組一同法接種計數。

　　陽性對照組：取保存在冰箱內同批制造的選擇性微生物菌懸液，同試驗組一同法接種數。

　　陰性對照組：另取0.9%無菌氯化鈉同法接種于TSA及沙氏葡萄瓊脂培養基上，作為陰性對照組。無菌隔離器